Écouvillons de transport

Des écouvillons nasopharyngés (NP) accrédités par les CDC ont été obtenus auprès de Fisher Scientific. Comme décrit précédemment, des virus SARS-CoV-2 inactivés par la chaleur et dilués en série dans du VTM ont été ajoutés directement au liquide nasal, de sorte que la concentration virale dans le liquide nasal variait de 25 UFP/μL à 0,0025 UFP/μL (2,5 à 250 copies par μL). Le liquide nasal enrichi (20 μL) a d'abord été absorbé par un écouvillon nasopharyngé, puis transféré dans 100 μL de VTM. L'écouvillon a été maintenu dans le VTM pendant 30 s à 1 min pour permettre la transition virale depuis l'écouvillon nasopharyngé.

Les réactifs RT-LAMP ont été préparés hors puce, puis chargés directement dans une seringue de 5 mL. Toutes les concentrations de réactifs ont été maintenues comme pour une réaction de 16 μL. Les deux seringues ont été connectées à la puce et l'échantillon a été chargé sur la puce sans utiliser de pousse-seringue. Une fois les réactifs d'échantillon et de réponse chargés dans la puce, les orifices situés sous les zones de réaction ont été obturés par une seconde couche adhésive double-face afin d'éviter toute fuite ou évaporation pendant l'incubation sous RT-LAMP.

L'étude a analysé l'impact de la pandémie de Covid-19 sur le chiffre d'affaires des leaders, des suiveurs et des acteurs perturbateurs du marché, et notre analyse en témoigne. Pour les expériences sur puce avec des échantillons cliniques de VTM et des échantillons de VTM enrichis, l'échantillon a été chargé dans une seringue de 1 ml.

Tout d'abord, l'échantillon patient lysé thermiquement et les réactifs RT-LAMP sont injectés via les connecteurs Luer-Lock femelles de deux seringues distinctes, sans utiliser de pompe microfluidique. Chaque port d'accès est directement relié au circuit d'écoulement 3D continu par une zone d'entrée en Y. Le motif circule ensuite dans la zone du micromélangeur 3D, où le flux effectue un virage vertical d'une face à l'autre entre chaque retournement horizontal en U.

Les 20 échantillons ont été analysés avec quatre réplicats de 2 μL chacun, affichant une reproductibilité élevée. Le test RT-LAMP évite l'isolement/la purification de l'ARN, réduisant ainsi le coût et la durée du test. Cependant, l'absence d'extraction et de concentration de l'ARN, ainsi que le faible volume d'échantillon (2 μL) utilisé dans chaque réaction, pourraient expliquer les résultats obtenus dans le test 9, où un réplicat n'a pas été amplifié, tandis qu'un autre a été amplifié ultérieurement. À terme, l'utilisation d'un volume d'essai plus important pourrait éviter les problèmes d'échantillonnage et améliorer la sensibilité.

La puce a été placée dans un support portable et fixée à l'aide de bandes magnétiques, de sorte que les microplaques soient en contact avec le dispositif de chauffage PTC tout au long de l'étape d'incubation de la RT-LAMP. L'incubation s'est déroulée à 65 °C pendant 60 minutes avec une surveillance en temps réel. La figure 4C montre la cartouche polymère jetable développée pour la détection rapide du SARS-CoV-2 dans le VTM. La conception 3D comprend des canaux microfluidiques sur les faces avant et arrière, reliés par des trous traversants de 1,7 mm × 0,7 mm² à l'extrémité de chaque microcanal serpentin. La puce a été conçue et fabriquée de manière additive en un seul élément pour réaliser trois fonctions sur puce.

Français Après avoir retiré l'écouvillon, l'échantillon VTM a été réparti en aliquotes de motifs et lysé thermiquement à 95 °C pendant 1 min. Enfin, le reste des réactifs pour la réaction RT-LAMP a été ajouté à l'échantillon pour un volume de réaction total de 16 μL. Sur la paillasse, notre test testé sur 20 échantillons de patients avait une précision de 100 %. 3 B–D, la sensibilité [définie comme Vrais Positifs/(Vrais Positifs + Faux Négatifs) et la spécificité (définie comme Vrais Négatifs/(Vrais Négatifs + Faux Positifs)] de notre test de paillasse étaient de 100 % dans les échantillons testés. Les 10 échantillons reconnus comme positifs par RT-PCR et les 10 échantillons reconnus comme négatifs par RT-PCR étaient également positifs et négatifs, respectivement, par notre test.

La face supérieure comporte sept canaux serpentins et la face inférieure huit, chaque microcanal serpentin mesurant 0,7 mm de large, 0,4 mm de profondeur et 8 mm de long. L'alternance de demi-tours horizontaux et verticaux améliore le mélange et permet un compactage dense de la structure de mélange. Enfin, le fluide s'écoule dans six réservoirs qui entourent radialement la bifurcation du canal d'écoulement. Ces réservoirs de détection, situés à l'extrémité de la puce, sont conçus pour contenir environ 20 μL par chambre. Les chambres d'amplification ont une paroi de 0,5 mm d'épaisseur et deux orifices de sortie de 1,1 mm de diamètre pour évacuer l'air excédentaire lors du remplissage.