Транспортные тампоны

Аккредитованные CDC носоглоточные тампоны были приобретены у компании Fisher Scientific. Как описано выше, серийно разведенные инактивированные нагреванием вирусы SARS-CoV-2 в VTM были добавлены непосредственно в носовую жидкость таким образом, чтобы концентрация вируса в образце составляла от 25 БОЕ/мкл до 0,0025 БОЕ/мкл (от 2,5E5 до 250 копий на мкл). Назальную жидкость с добавкой (20 мкл) сначала абсорбировали носоглоточным тампоном, а затем переносили в 100 мкл VTM. Тампон помещали в VTM на 30 с – 1 мин для переключения вируса из носоглоточного тампона.

Реагенты для RT-LAMP были приготовлены вне чипа и загружены непосредственно в шприц объёмом 5 мл. Все концентрации реагентов поддерживались как в реакции объёмом 16 мкл. Оба шприца были подключены к чипу, и образец был загружен на чип без использования шприцевого насоса. После загрузки реагентов для паттерна и ответа на чип отверстия под пулами для пиров были запечатаны вторым двусторонним слоем клея для предотвращения утечки или испарения во время инкубации в RT-LAMP.

В отчёте анализируется влияние пандемии COVID-19 на выручку лидеров рынка, последователей рынка и новаторов, что отражено в нашем анализе. Для экспериментов на чипе с клиническими образцами VTM и образцами VTM с добавлением меченых частиц образец загружался в шприц объёмом 1 мл.

Сначала термически лизированный образец пациента и реагенты RT-LAMP вводятся через коннекторы Luer Lock с внутренней резьбой двумя отдельными шприцами без использования микрофлюидных насосов. Каждый порт доступа непосредственно связан с непрерывным трёхмерным потоком через Y-образную входную зону. Затем поток проходит через трёхмерную зону микромиксера, где циркуляция совершает вертикальный поворот с одной стороны на другую между каждым горизонтальным U-образным переворотом.

20 образцов были проанализированы с использованием четырёх повторов по 2 мкл каждый, что продемонстрировало высокую воспроизводимость. Анализ RT-LAMP позволяет избежать необходимости выделения/очистки РНК, что снижает общую стоимость и время анализа. Однако исключение этапа экстракции и концентрирования РНК, а также небольшой объём образца (2 мкл), используемый в каждой реакции, могут прояснить результаты, полученные в образце 9, где один повтор не амплифицируется, а другой амплифицируется позже. В долгосрочной перспективе использование большего количества образца может исключить точки отбора проб и повысить чувствительность.

Чип был помещен в портативный держатель и закреплен магнитными полосками таким образом, чтобы зоны контакта с PTC-нагревателем обеспечивали хороший контакт на протяжении всего этапа инкубации RT-LAMP. Инкубация проводилась при температуре 65 °C в течение 60 минут с мониторингом в режиме реального времени. На рисунке 4C показан одноразовый полимерный картридж, разработанный для быстрого обнаружения SARS-CoV-2 в VTM. 3D-конструкция состоит из микрофлюидных каналов на задней и передней сторонах, соединенных сквозными отверстиями размером 1,7 мм × 0,7 мм² на конце каждого змеевидного микроканала. Чип был спроектирован и изготовлен методом аддитивной обработки как единый элемент, выполняющий три функции на чипе.

После удаления тампона образец VTM был распределен по аликвотам и подвергнут термическому лизису при 95 °C в течение 1 мин. Наконец, к образцу были добавлены оставшиеся реагенты для реакции RT-LAMP для общего объема реакции 16 мкл. На настольном компьютере наш анализ, проверенный на 20 образцах пациентов, имел 100% точность. три B–D, чувствительность [обозначенная как Истинно положительные/(Истинно положительные + Ложно отрицательные) и специфичность (определяемая как Истинно отрицательные/(Истинно отрицательные + Ложно положительные)] нашего настольного анализа составила 100% для протестированных образцов. Все 10 образцов, идентифицированных как конструктивные с помощью ОТ-ПЦР, и все 10 образцов, идентифицированных как отрицательные с помощью ОТ-ПЦР, также были конструктивными и отрицательными, соответственно, с помощью нашего анализа.

На верхней грани расположено семь змеевидных каналов, а на нижней – восемь. Каждый змеевидный микроканал имеет ширину 0,7 мм, глубину 0,4 мм и длину 8 мм. Чередующиеся горизонтальные и вертикальные U-образные изгибы улучшают перемешивание и обеспечивают плотную упаковку смесительной конструкции. В конечном итоге жидкость поступает в шесть резервуаров, радиально окружающих разветвление каналов потока. Эти резервуары обнаружения, расположенные на конце чипа, рассчитаны на объём около 20 мкл на камеру. Камеры усиления имеют толщину стенки 0,5 мм и два выходных отверстия диаметром 1,1 мм для удаления излишков воздуха во время заполнения.