Tamponi di trasporto

I tamponi NP accreditati dal CDC erano stati ottenuti commercialmente da Fisher Scientific. Come descritto sopra, i virus SARS-CoV-2 inattivati ​​termicamente in VTM diluiti in serie erano stati aggiunti direttamente al fluido nasale in modo che la concentrazione virale del campione nel fluido nasale variasse da 25 PFU/μL a 0,0025 PFU/μL (da 2,5E5 a 250 copie per μL). Il fluido nasale aggiunto (20 μL) è stato prima assorbito da un tampone NP e poi trasferito in 100 μL di VTM. Il tampone è stato immerso nel VTM per 30 secondi-1 minuto per la conversione virale dal tampone NP.

I reagenti RT-LAMP sono stati preparati off-chip e poi caricati direttamente in una siringa da 5 mL. Tutte le concentrazioni dei reagenti sono state mantenute come in una reazione da 16 μL. Entrambe le siringhe sono state collegate al chip e il campione è stato caricato sul chip senza utilizzare una pompa a siringa. Una volta caricati i reagenti di pattern e risposta nel chip, i fori sotto i pool di pie sono stati sigillati con un secondo strato biadesivo per evitare perdite o evaporazione durante l'incubazione RT-LAMP.

Il rapporto di studio ha analizzato l'impatto della pandemia di Covid-19 sui ricavi delle vendite di leader di mercato, follower di mercato e disruptor, e lo stesso si riflette nella nostra analisi. Per gli esperimenti su chip con campioni clinici di VTM e campioni di VTM arricchiti, il campione è stato caricato direttamente in una siringa da 1 ml.

Innanzitutto, il campione del paziente sottoposto a lisazione termica e i reagenti RT-LAMP vengono iniettati tramite i connettori Luer-lock femmina da due siringhe separate, senza l'uso di pompe microfluidiche. Ogni porta di accesso è direttamente collegata al percorso del flusso 3D continuo tramite un'area di ingresso a Y. Quindi, il flusso fluisce attraverso l'area del micromiscelatore 3D, dove il flusso compie una curva verticale da una faccia all'altra tra ogni inversione a U orizzontale.

I 20 campioni sono stati analizzati con quattro repliche da 2 μL ciascuna, mostrando un'elevata riproducibilità. Il test RT-LAMP evita la necessità di isolamento/purificazione dell'RNA, riducendo i costi e i tempi complessivi del test. Tuttavia, l'eliminazione della fase di estrazione e concentrazione dell'RNA, insieme al piccolo volume di campione (2 μL) utilizzato in ciascuna reazione, potrebbe spiegare i risultati ottenuti nel test 9, in cui una replica non si è amplificata e un'altra replica si è amplificata in un secondo momento. A lungo termine, l'uso di una quantità di campione maggiore potrebbe ridurre i tempi di campionamento e aumentare la sensibilità.

Il chip è stato posizionato in una culla portatile e fissato con strisce magnetiche, in modo che i pool di pie mantenessero un buon contatto con il riscaldatore PTC durante tutta la fase di incubazione RT-LAMP. L'incubazione è avvenuta a 65 °C per 60 minuti con monitoraggio in tempo reale. La Figura 4C mostra la cartuccia polimerica monouso sviluppata per il rilevamento rapido di SARS-CoV-2 in VTM. Il design 3D è costituito da canali microfluidici sia sul lato posteriore che su quello anteriore, collegati da fori passanti da 1,7 mm × 0,7 mm² all'estremità di ogni microcanale a serpentina. Il chip è stato progettato e prodotto in modo additivo come un singolo elemento per completare tre funzioni on-chip.

Dopo aver rimosso il tampone, il campione di VTM è stato distribuito in aliquote campione e sottoposto a lisi termica a 95 °C per 1 minuto. Infine, il resto dei reagenti per la reazione RT-LAMP è stato aggiunto al campione per un volume di reazione totale di 16 μL. Sul banco di prova, il nostro test testato su 20 campioni di pazienti ha avuto un'accuratezza del 100%. 3 B–D, la sensibilità [definita come Veri Positivi/(Veri Positivi + Falsi Negativi)] e la specificità (definita come Veri Negativi/(Veri Negativi + Falsi Positivi)] del nostro test da banco erano del 100% nei campioni testati. Tutti i 10 campioni riconosciuti come positivi tramite RT-PCR e tutti i 10 campioni identificati come negativi tramite RT-PCR erano rispettivamente positivi e negativi tramite il nostro test.

Sono presenti sette canali a serpentina sulla faccia superiore e otto sulla faccia inferiore, con ogni microcanale a serpentina largo 0,7 mm, profondo 0,4 mm e lungo 8 mm. Le curve a U orizzontali e verticali alternate migliorano la miscelazione e consentono un denso riempimento della struttura di miscelazione. Infine, il fluido scorre in sei serbatoi che circondano radialmente la biforcazione del canale di flusso. Questi serbatoi di rilevamento posizionati all'estremità del chip sono progettati per contenere una quantità di circa 20 μL per camera. Le camere di amplificazione hanno una parete spessa 0,5 mm e due fori di uscita di 1,1 mm di diametro per rimuovere l'aria in eccesso durante il riempimento.