Hisopos de transporte

Los hisopos nasofaríngeos acreditados por los CDC se obtuvieron comercialmente de Fisher Scientific. Como se describió anteriormente, se introdujeron virus SARS-CoV-2 inactivados por calor en el VTM, diluidos en serie, directamente en el fluido nasal, de modo que la concentración viral en el fluido nasal oscilara entre 25 UFP/μL y 0,0025 UFP/μL (2,5E5 a 250 copias por μL). El fluido nasal inactivado (20 μL) se absorbió primero con un hisopo nasofaríngeo y luego se transfirió a 100 μL de VTM. El hisopo se removió en el VTM durante 30 s a 1 min para la transferencia viral del hisopo nasofaríngeo.

Los reactivos RT-LAMP se prepararon fuera del chip y se cargaron directamente en una jeringa de 5 ml. Todas las concentraciones de reactivos se mantuvieron como en una reacción de 16 μL. Ambas jeringas se conectaron al chip y la muestra se cargó en el chip sin usar una bomba de jeringa. Una vez cargados los reactivos de muestra y de reacción en el chip, los orificios bajo los pools circulares se sellaron con una segunda capa adhesiva de doble cara para evitar fugas o evaporación durante la incubación con RT-LAMP.

El estudio del informe ha analizado el impacto de la pandemia de COVID-19 en los ingresos por ventas de líderes, seguidores y disruptores del mercado, y lo mismo se refleja en nuestro análisis. Para los experimentos en chip con muestras clínicas de VTM y muestras de VTM enriquecidas, la muestra se cargó en una jeringa de 1 ml.

En primer lugar, se inyectan la muestra del paciente lisada térmicamente y los reactivos RT-LAMP mediante conectores Luer-Lock hembra desde dos jeringas independientes, sin necesidad de bombas microfluídicas. Cada puerto de acceso está conectado directamente a la vía de flujo 3D continuo mediante una entrada en forma de Y. A continuación, el patrón fluye a través del área del micromixer 3D, donde el flujo realiza un giro vertical entre cada giro horizontal en U.

Las 20 muestras se analizaron con cuatro réplicas de 2 μL cada una, lo que demostró una alta reproducibilidad. El ensayo RT-LAMP evita el aislamiento/purificación del ARN, lo que reduce el coste y la duración del ensayo. Sin embargo, omitir la extracción y concentración del ARN, junto con el pequeño volumen de muestra (2 μL) utilizado en cada reacción, podría explicar los resultados obtenidos en la muestra 9, donde una réplica no amplificó y otra sí lo hizo posteriormente. A largo plazo, el uso de un mayor volumen de ensayo podría evitar problemas de muestreo y mejorar la sensibilidad.

El chip se colocó en una base portátil y se sujetó con bandas magnéticas, de modo que los depósitos circulares mantuvieran un buen contacto con el calentador PTC durante todo el proceso de incubación con RT-LAMP. La incubación se realizó a 65 °C durante 60 min con monitorización en tiempo real. La figura 4C muestra el cartucho de polímero desechable desarrollado para la detección rápida del SARS-CoV-2 en VTM. El diseño 3D consta de canales microfluídicos en las caras frontal y posterior, conectados por orificios pasantes de 1,7 mm × 0,7 mm² en el extremo de cada microcanal serpentino. El chip se diseñó y fabricó de forma aditiva como un único componente para realizar tres funciones en el chip.

Tras retirar el hisopo, la muestra de VTM se distribuyó en alícuotas patrón y se lisó térmicamente a 95 °C durante 1 min. Finalmente, se añadieron a la muestra el resto de los reactivos de la reacción RT-LAMP, obteniendo un volumen total de reacción de 16 μL. En la mesa de trabajo, nuestro ensayo, examinado en 20 muestras de pacientes, mostró una precisión del 100 %. 3 B–D, la sensibilidad [definida como verdaderos positivos/(verdaderos positivos + falsos negativos) y la especificidad [definida como verdaderos negativos/(verdaderos negativos + falsos positivos)] de nuestro ensayo de sobremesa fueron del 100 % en las muestras analizadas. Las 10 muestras identificadas como positivas mediante RT-PCR y las 10 muestras identificadas como negativas mediante RT-PCR también dieron positivo y negativo, respectivamente, en nuestro ensayo.

Hay siete canales serpentinos en la cara superior y ocho en la inferior. Cada microcanal serpentino mide 0,7 mm de ancho, 0,4 mm de profundidad y 8 mm de largo. Los giros en U horizontales y verticales alternados mejoran la mezcla y permiten un empaquetamiento denso de la estructura de mezcla. Finalmente, el fluido fluye hacia seis depósitos que rodean radialmente la bifurcación del canal de flujo. Estos depósitos de detección, ubicados en el extremo del chip, están diseñados para contener una cantidad de ∼20 μL por cámara. Las cámaras de amplificación tienen una pared de 0,5 mm de espesor y dos orificios de salida de 1,1 mm de diámetro para eliminar el exceso de aire durante el llenado.