Cotonetes de transporte

Os swabs de NP credenciados pelo CDC foram obtidos comercialmente da Fisher Scientific. Conforme descrito acima, vírus SARS-CoV-2 inativados pelo calor, diluídos em série em VTM, foram adicionados diretamente ao fluido nasal, de modo que a concentração viral da amostra no fluido nasal variou de 25 PFU/μL a 0,0025 PFU/μL (2,5E5 a 250 cópias por μL). O fluido nasal adicionado (20 μL) foi primeiramente absorvido por um swab de NP e, em seguida, transferido para 100 μL de VTM. O swab foi misturado ao VTM por 30 s a 1 min para a transferência viral do swab de NP.

Os reagentes RT-LAMP foram preparados fora do chip e, em seguida, carregados em uma seringa de 5 mL. Todas as concentrações dos reagentes foram mantidas como em uma reação de 16 μL. Ambas as seringas foram conectadas ao chip e a amostra foi carregada no chip sem o uso de uma bomba de seringa. Após o carregamento dos reagentes de amostra e resposta no chip, os orifícios sob os pools de amostras foram selados com uma segunda camada adesiva dupla-face para evitar vazamento ou evaporação durante a incubação com RT-LAMP.

O relatório analisou a influência da pandemia de COVID-19 na receita de vendas de líderes de mercado, seguidores de mercado e disruptores, e o mesmo se reflete em nossa análise. Para experimentos em chip com amostras clínicas de VTM e amostras de VTM enriquecidas, a amostra foi carregada em uma seringa de 1 mL.

Primeiramente, a amostra do paciente lisada termicamente e os reagentes RT-LAMP são injetados através dos conectores Luer lock fêmea de duas seringas separadas, sem o uso de bombas microfluídicas. Cada porta de acesso é diretamente conectada à via de fluxo 3D contínua por uma área de entrada em forma de Y. Em seguida, o fluxo flui pela área do micromisturador 3D, onde o fluxo faz uma curva vertical de uma face para a outra entre cada inversão horizontal em U.

As 20 amostras foram analisadas com quatro réplicas de 2 μL cada, demonstrando alta reprodutibilidade. O ensaio RT-LAMP dispensa a necessidade de isolamento/purificação do RNA, reduzindo o custo e o tempo geral do ensaio. No entanto, a dispensa da etapa de extração e concentração do RNA, juntamente com o pequeno volume de amostra (2 μL) utilizado em cada reação, pode esclarecer os resultados obtidos na amostra 9, onde uma réplica não amplificou e outra amplificou posteriormente. A longo prazo, o uso de um volume maior de ensaio pode evitar problemas de amostragem e aumentar a sensibilidade.

O chip foi posicionado em um suporte portátil e fixado com tiras magnéticas, de modo que as camadas de torta fizessem bom contato com o aquecedor PTC durante toda a etapa de incubação com RT-LAMP. A incubação ocorreu a 65 °C por 60 minutos, com monitoramento em tempo real. A Figura 4C mostra o cartucho de polímero descartável desenvolvido para a detecção rápida de SARS-CoV-2 em VTM. O design 3D consiste em microcanais fluídicos nas faces frontal e traseira, conectados por furos de passagem de 1,7 mm × 0,7 mm² na extremidade de cada microcanal serpentino. O chip foi projetado e fabricado aditivamente como um único componente para executar três funções no chip.

Após a remoção do cotonete, a amostra de VTM foi distribuída em alíquotas de padrão e lisada termicamente a noventa e cinco °C por 1 min. Finalmente, o restante dos reagentes para a reação de RT-LAMP foram adicionados à amostra para um volume total de reação de 16 μL. Na bancada, nosso ensaio examinado em 20 amostras de pacientes teve uma precisão de 100%. 3 B–D, a sensibilidade [definida como Verdadeiros Positivos/(Verdadeiros Positivos + Falso Negativo) e especificidade (definida como Verdadeiros Negativos/(Verdadeiros Negativos + Falsos Positivos)] do nosso ensaio de bancada foi de 100% nas amostras testadas. Todas as 10 amostras identificadas como construtivas por RT-PCR e todas as 10 amostras identificadas como negativas por RT-PCR também foram construtivas e negativas, respectivamente, através do nosso ensaio.

Existem sete canais serpentinos na face superior e oito na face inferior, com cada microcanal serpentino medindo 0,7 mm de largura, 0,4 mm de profundidade e 8 mm de comprimento. As curvas em U horizontais e verticais alternadas melhoram a mistura e permitem um compactamento denso da estrutura de mistura. Finalmente, o fluido flui para seis reservatórios que circundam radialmente a bifurcação do canal de fluxo. Esses reservatórios de detecção, localizados na extremidade do chip, são projetados para conter uma quantidade de aproximadamente 20 μL por câmara. As câmaras de amplificação têm uma parede de 0,5 mm de espessura e dois orifícios de saída de 1,1 mm de diâmetro para remover o excesso de ar durante o enchimento.