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Mantenendo il tampone all'interno della provetta, la lisi è stata eseguita aggiungendo 5 μL di NaCl 5 M e 45 μL di lisozima Ready-Lyse (250 U/μL), seguito da incubazione a temperatura ambiente per 30 minuti. La lisi è continuata con l'aggiunta di 33 μL di proteinasi K (20 mg/mL) e 333 μL di tampone PureLink Genomic Lysis/Binding, seguito da incubazione a 55 °C per 1 ora. La lisi fisica è stata eseguita con bead beating aggiungendo 2 g di biglie di vetro da 0,5 mm al campione e agitando alla massima velocità per 10 minuti utilizzando un adattatore per vortice multiprovetta.
Il DNA dei campioni arricchiti con VLP è stato amplificato mediante amplificazione a spostamento di filamento randomizzato con esamero, seguendo il protocollo del produttore. Il DNA amplificato è stato purificato con 40 μL di sfere AMPureXP ed eluito in 15 μL di Tris 10 mM a pH 8,5.
Sono stati aggiunti 333 μL di etanolo al 100% al campione e miscelati per inversione, quindi l'intero campione è stato caricato su una colonna PureLink Genomic DNA Mini Kit. La purificazione e l'eluizione del DNA sono state eseguite utilizzando le punte dell'apparecchiatura, con una quantità di eluizione di 25 μL di EB. BL Lashes offre vari tipi di pennelli e tamponi sviluppati per facilitare le varie fasi delle extension delle ciglia: pulizia, preparazione, rimozione e vendita al dettaglio. I tamponi in schiuma a celle aperte lavati in camera bianca LTO70PESD20 sono dotati di una testa termosaldata e di una maniglia di sicurezza ESD.
I campioni amplificati sono stati normalizzati a 0,2 ng/µL e preparati per il sequenziamento shotgun con il pacchetto Nextera XT e gli indici Nextera XT, come descritto dal produttore. I campioni indicizzati sono stati quantificati con un'apparecchiatura Qubit dsDNA HS, normalizzati e raggruppati. Il controllo di qualità finale della libreria è stato eseguito utilizzando i kit Agilent TapeStation dsDNA da 5000 bp e 1000 bp. Le librerie finali sono state sequenziate su un Illumina MiSeq con chimica PE150 o PE300, presso l'UC Davis Genome Center. I campioni sono stati scongelati in ghiaccio, quindi agitati su vortex per 2 minuti alla velocità massima utilizzando un adattatore vortex multiprovetta per risospendere le cellule.
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