Tamponi rettali per l'analisi dell'intestino

Tuttavia, non è stata riscontrata alcuna variazione aggiuntiva conservando i tamponi a temperatura ambiente in RTF per 2 ore rispetto al congelamento immediato in azoto liquido. La maggior parte dei test molecolari per il COVID-19 attualmente disponibili sul mercato utilizza un metodo di raccolta del campione che richiede l'inserimento dei tamponi nelle vie nasali e faringee. I tamponi stessi contenenti il ​​campione vengono quindi trasportati in 2-3 ml di terreno di trasporto virale comune e devono essere conservati al freddo con impacchi di ghiaccio o ghiaccio secco e processati entro poche ore. Poiché i tamponi rimangono immersi nel terreno di trasporto virale, il CDC e la FDA raccomandano l'utilizzo di tamponi con punta sintetica, idealmente con aste in plastica o alluminio.

Un problema centrale è la bassa biomassa dei fagi nei campioni ottenuti da pelle e ferite, che porta a materiale insufficiente per il sequenziamento o a una profondità di sequenziamento insufficiente. Le strategie precedentemente riportate tendono a essere prolungate, non ottimizzate per campioni di piccole quantità e a bassa biomassa e/o non trattengono la frazione non-VLP del microbioma, richiedendo l'acquisizione di un secondo campione per il viroma e la valutazione completa del microbioma. Per verificare se questa tecnica di elaborazione abbia migliorato o meno il ripristino del DNA fagico da campioni di tamponi medici, sono stati ottenuti tamponi da pelle e ferite normali raccolti da pazienti presso una clinica specializzata in ferite e trattati in preparazione per il sequenziamento ad alta produttività. Abbiamo confrontato il nuovo metodo di preparazione del campione con una normale tecnica di estrazione basata su kit, misurando le rese di dsDNA per via fluorimetrica.

La varianza di conservazione, introdotta conservando i tamponi a temperatura ambiente in tampone RTF anziché congelarli rapidamente, è stata stimata pari a 0,79 per Bacteroidetes e 1,14 per AFFV. Pertanto, è stata generata una varianza maggiore prelevando più campioni rispetto a test ripetuti dello stesso campione.

Sebbene i campioni PS2 contenessero più DNA umano rispetto a PS1, la maggiore frazione di letture virali (Fig. 6b) si traduceva anche in un numero assoluto più elevato di letture mappate su IMG/VR. Con il progredire della ricerca sul microbioma, cresce l'interesse per il viroma, relativamente poco studiato. Tuttavia, la metodologia sperimentale per il campionamento del viroma non è stata caratterizzata e ottimizzata in modo così approfondito come le strategie per l'elaborazione dei pattern batterici.

Ulteriori confronti della composizione del DNA arricchito con VLP da tamponi scientifici di pelle e ferite utilizzando l'estrazione basata su pacchetti e la strategia qui descritta. Il DNA arricchito con VLP è stato sequenziato con tecnica shotgun e mappato nel database del metagenoma virale IMG/VR o nel genoma umano.

Da questa valutazione emerge che tamponi rettali, campioni fecali e biopsie mucose potrebbero talvolta essere molto correlati, ma che nel complesso questi tre tipi di pattern sembrano ospitare microbioti più o meno distinti. La varianza stimata per test ripetuti sugli stessi campioni è stata di 0,25 log2RFU per Bacteroidetes e 0,37 log2RFU per AFFV. La varianza totale del campionamento, che include la varianza introdotta da campionamenti ripetuti e test ripetuti, è stata stimata in 0,78 log2RFU per Bacteroidetes e 1,16 log2RFU per AFFV.

Tra i campioni VLP contenenti una quantità rilevabile di DNA, PS2 ha prodotto una concentrazione di DNA totale rispettivamente 6,7 e 4,4 volte maggiore per tamponi cutanei e di ferite, rispetto a PS1. Si prevede che le frazioni rimanenti, che includono batteri sostanziali, contengano più DNA e, come previsto, quasi tutti i campioni di pelle e ferite hanno prodotto una quantità rilevabile di DNA nella frazione rimanente. Inoltre, PS2 ha prodotto una concentrazione di DNA totale 3,9 e 16,6 volte maggiore rispetto a PS1, indicando che PS2 migliorerebbe ulteriormente la resa di DNA per lo studio completo del metagenoma. Il ruolo del microbioma nella salute e nelle malattie umane è diventato sempre più riconosciuto nell'ultimo decennio. I miglioramenti metodologici nell'elaborazione dei modelli, nel sequenziamento e nella bioinformatica sono essenziali per far progredire la ricerca sulla varietà filogenetica e utile dei microbi che colonizzano il corpo umano.

Utilizzando PS1, solo il 10% delle frazioni di VLP cutanee e il 25% delle frazioni di VLP da ferita hanno prodotto DNA rilevabile. Tuttavia, PS2 ha prodotto un miglioramento significativo, producendo DNA rilevabile nel 30% dei campioni di VLP cutanei e nel 100% dei campioni di VLP da ferita (Fig. 5).