Swabs retais para análise do intestino

No entanto, nenhuma variação adicional foi gerada pelo armazenamento de swabs em temperatura ambiente em RTF por 2 horas, em comparação ao congelamento rápido em nitrogênio líquido. A maioria dos testes moleculares para COVID-19 existentes no mercado utiliza um método de coleta de amostras que exige a inserção de swabs na passagem nasal e na garganta. Os próprios swabs contendo a amostra são então transportados em 2 a 3 mL de meio de transporte viral comum e devem ser armazenados refrigerados com bolsas de gelo ou gelo seco e processados ​​em poucas horas. Como os swabs permanecem imersos no UTM, o CDC e o FDA recomendam o uso de swabs com ponta sintética, idealmente com hastes de plástico ou alumínio.

Um problema central é a baixa biomassa de fagos em amostras obtidas de poros, pele e feridas, o que leva à insuficiência de material para sequenciamento ou à profundidade de sequenciamento insuficiente. Estratégias relatadas anteriormente tendem a ser prolongadas, não otimizadas para amostras de pequena quantidade e baixa biomassa e/ou não retêm a fração não VLP do microbioma, exigindo a aquisição de uma segunda amostra para avaliação do viroma e do microbioma completo. Para testar se essa técnica de processamento melhorou ou não a restauração do DNA do fago a partir de amostras de swab médico, swabs foram obtidos de poros, pele e feridas comuns, coletados de pacientes em uma clínica de feridas e processados ​​em preparação para sequenciamento de alto rendimento. Comparamos o novo método de preparação de amostras com uma técnica de extração tradicional baseada em kit, medindo os rendimentos de dsDNA por fluorometria.

A variância de armazenamento, introduzida pelo armazenamento de swabs à temperatura ambiente em tampão RTF como alternativa ao congelamento rápido direto, foi estimada em 0,79 para Bacteroidetes e 1,14 para AFFV. Assim, uma variância maior foi gerada pela coleta de múltiplas amostras em comparação com testes repetidos do mesmo padrão.

Embora as amostras de PS2 contivessem mais DNA humano do que as de PS1, a maior fração de leituras virais (Fig. 6b) também se traduziu em um maior número absoluto de leituras mapeadas para IMG/VR. À medida que a pesquisa sobre microbioma avança, há um interesse crescente no viroma, relativamente pouco estudado. No entanto, a metodologia experimental para amostragem de viroma não foi caracterizada e otimizada tão extensivamente quanto as estratégias para processamento de padrões bacterianos.

Comparações adicionais da composição de DNA enriquecido com VLP a partir de swabs científicos de pele e feridas utilizando extração baseada em pacote e a estratégia descrita aqui. O DNA enriquecido com VLP foi sequenciado por shotgun e mapeado para o banco de dados de metagenoma viral IMG/VR ou para o genoma humano.

A partir desta avaliação, torna-se evidente que swabs retais, amostras fecais e biópsias de mucosa podem, por vezes, estar muito relacionados, mas que, no geral, esses três tipos de padrões parecem abrigar microbiotas mais ou menos distintas. A variância estimada para testes repetidos das mesmas amostras foi de 0,25 log2RFU para Bacteroidetes e 0,37 log2RFU para AFFV. A variância total da amostragem, que inclui a variância introduzida por amostragem repetida, bem como por testes repetidos, foi estimada em 0,78 log2RFU para Bacteroidetes e 1,16 log2RFU para AFFV.

Das amostras de VLP contendo uma quantidade detectável de DNA, o PS2 produziu uma concentração de DNA comum 6,7 e 4,4 vezes maior para swabs de pele e feridas, respectivamente, em comparação com o PS1. Espera-se que as frações restantes, que incluem bactérias substanciais, contenham mais DNA e, como esperado, praticamente todas as amostras de pele e feridas produziram uma quantidade detectável de DNA na fração restante. Além disso, o PS2 produziu 3,9 e 16,6 vezes maior concentração de DNA comum em comparação com o PS1, indicando que o PS2 também melhoraria o rendimento de DNA para estudos completos de metagenoma. O papel do microbioma na saúde e na doença humana tornou-se cada vez mais reconhecido na última década. Aprimoramentos metodológicos em processamento de padrões, sequenciamento e bioinformática são essenciais para o avanço da pesquisa da diversidade filogenética e funcional dos micróbios que colonizam o corpo humano.

Utilizando PS1, apenas 10% das frações de VLP da pele e 25% das frações de VLP da ferida produziram DNA detectável. No entanto, o PS2 apresentou melhora significativa, produzindo DNA detectável em 30% das amostras de VLP da pele e 100% das amostras de VLP da ferida (Fig. 5).