Hisopos rectales para análisis del intestino

Sin embargo, no se observó ninguna variación adicional al almacenar los hisopos a temperatura ambiente en RTF durante 2 horas, en comparación con su congelación instantánea en nitrógeno líquido. La mayoría de las pruebas moleculares de COVID-19 disponibles en el mercado requieren un método de recolección de muestras que requiere la inserción de hisopos en la fosa nasal y la garganta. Los hisopos que contienen la muestra se transportan en 2-3 ml de medio de transporte común viral y deben almacenarse en frío con compresas frías o hielo seco, para su procesamiento en cuestión de horas. Dado que los hisopos permanecen sumergidos en el UTM, los CDC y la FDA recomiendan el uso de hisopos con punta sintética, idealmente con mangos de plástico o aluminio.

Un problema central es la baja biomasa de fagos en muestras obtenidas de piel y heridas, lo que resulta en material insuficiente para la secuenciación o una secuenciación de baja profundidad. Las estrategias descritas previamente tienden a ser prolongadas, no están optimizadas para muestras pequeñas y de baja biomasa, o no conservan la fracción no VLP del microbioma, lo que requiere la adquisición de una segunda muestra para el viroma y la evaluación completa del microbioma. Para evaluar si esta técnica de procesamiento mejoraba la recuperación del ADN de fagos en muestras de hisopos médicos, se obtuvieron hisopos de piel y heridas comunes recolectadas de pacientes en una clínica de heridas y se procesaron para la secuenciación de alto rendimiento. Comparamos este novedoso método de preparación de muestras con un método de extracción estándar basado en un kit, midiendo los rendimientos de dsADN mediante fluorometría.

La varianza de almacenamiento, introducida al almacenar los hisopos a temperatura ambiente en tampón RTF en lugar de congelación rápida directa, se estimó en 0,79 para Bacteroidetes y 1,14 para AFFV. Por lo tanto, se generó una mayor varianza al tomar múltiples muestras en comparación con el análisis repetido del mismo patrón.

Aunque las muestras de PS2 contenían más ADN humano que las de PS1, la mayor proporción de lecturas virales (Fig. 6b) también se tradujo en un mayor número absoluto de lecturas asignadas a IMG/VR. A medida que avanza la investigación sobre el microbioma, crece el interés por el viroma, relativamente poco estudiado. Sin embargo, la metodología experimental para el muestreo del viroma no se ha caracterizado ni optimizado tan exhaustivamente como las estrategias para el procesamiento de patrones bacterianos.

Comparaciones adicionales de la composición del ADN enriquecido con VLP a partir de hisopos científicos de piel y heridas mediante extracción basada en paquetes y la estrategia descrita aquí. El ADN enriquecido con VLP se secuenció por escopeta y se mapeó en la base de datos de metagenomas virales IMG/VR o en el genoma humano.

A partir de esta evaluación, se hace evidente que los hisopos rectales, las muestras fecales y las biopsias de mucosa a veces podrían estar muy relacionados, pero que, en general, estos tres tipos de patrones parecen albergar una microbiota más o menos distinta. La varianza estimada para las pruebas repetidas de las mismas muestras fue de 0,25 log²RFU para Bacteroidetes y de 0,37 log²RFU para AFFV. La varianza total del muestreo, que incluye la varianza introducida por el muestreo repetido y las pruebas repetidas, se estimó en 0,78 log²RFU para Bacteroidetes y de 1,16 log²RFU para AFFV.

De las muestras de VLP que contenían una cantidad detectable de ADN, PS2 produjo una concentración de ADN común 6,7 y 4,4 veces mayor para hisopos de piel y heridas, respectivamente, en comparación con PS1. Se espera que las fracciones restantes, que incluyen microorganismos sustanciales, contengan más ADN y, como se anticipó, prácticamente todas las muestras de piel y heridas produjeron una cantidad detectable de ADN en la fracción restante. Además, PS2 proporcionó una concentración de ADN común 3,9 y 16,6 veces mayor en comparación con PS1, lo que indica que PS2 también mejoraría el rendimiento de ADN para la investigación completa del metagenoma. El papel del microbioma en la salud y la enfermedad humanas se ha vuelto cada vez más reconocido durante la última década. Las mejoras metodológicas en el procesamiento de patrones, la secuenciación y la bioinformática son esenciales para avanzar en la investigación de la variedad filogenética y útil de los microbios que colonizan el cuerpo humano.

Con PS1, solo el 10 % de las fracciones de VLP de piel y el 25 % de las fracciones de VLP de heridas produjeron ADN detectable. Sin embargo, con PS2 se obtuvo una mejora significativa, produciendo ADN detectable en el 30 % de las muestras de VLP de piel y el 100 % de las muestras de VLP de heridas (Fig. 5).