Ректальные мазки для анализа кишечника

Однако никаких дополнительных различий при хранении тампонов при комнатной температуре в RTF в течение 2 часов по сравнению с их быстрой заморозкой в ​​жидком азоте не наблюдалось. Большинство существующих на рынке молекулярных тестов на COVID-19 используют метод отбора образцов, требующий введения тампонов в носовой ход и горло. Тампоны с образцом затем транспортируются в 2–3 мл обычной вирусной транспортной среды и должны храниться в холодильнике с пакетами со льдом или сухим льдом и обрабатываться в течение нескольких часов. Поскольку тампоны остаются погруженными в UTM, CDC и FDA рекомендуют использовать тампоны с синтетическим наконечником, в идеале с пластиковым или алюминиевым стержнем.

Одной из основных проблем является низкая биомасса фагов в образцах, полученных из пор, кожи и ран, что приводит к недостаточному количеству материала для секвенирования или недостаточной глубине секвенирования. Ранее описанные методы, как правило, длительны, не оптимизированы для небольших объемов образцов с низкой биомассой и/или не сохраняют фракцию микробиома, не содержащую вирусоподобных частиц, что требует получения второго образца для анализа вирома и полной оценки микробиома. Чтобы проверить, улучшает ли этот метод обработки восстановление фаговой ДНК из образцов медицинских мазков, были получены мазки из обычных образцов кожи и ран, собранных у пациентов в раневой клинике, и обработаны в рамках подготовки к высокопроизводительному секвенированию. Мы сравнили новый метод подготовки образцов с традиционным методом экстракции с использованием наборов, измеряя выход двуцепочечной ДНК флуориметрическим методом.

Дисперсия при хранении, вызванная хранением тампонов при комнатной температуре в буфере RTF вместо прямого быстрого замораживания, оценивалась в 0,79 для Bacteroidetes и 1,14 для AFFV. Таким образом, дополнительная дисперсия была получена при отборе нескольких образцов по сравнению с повторным тестированием одного и того же образца.

Хотя образцы PS2 содержали больше человеческой ДНК, чем образцы PS1, большая доля вирусных прочтений (рис. 6b) также приводила к большему абсолютному числу прочтений, картированных с IMG/VR. По мере развития исследований микробиома растёт интерес к сравнительно малоизученному вирому. Однако экспериментальная методология отбора проб вирома не была так подробно описана и оптимизирована, как стратегии обработки бактериальных паттернов.

Дополнительное сравнение состава ДНК, обогащённой вирусоподобными частицами (ВПЧ), из мазков с кожи и ран, полученных в ходе научных исследований, с использованием преимущественно пакетной экстракции и описанной здесь стратегии. ДНК, обогащённая ВПЧ, была секвенирована методом дробовика и сопоставлена ​​с базой данных вирусного метагенома IMG/VR или геномом человека.

Из этой оценки становится очевидным, что ректальные мазки, образцы кала и биопсии слизистой оболочки иногда могут быть очень схожи, но в целом эти три типа образцов, по-видимому, содержат более или менее различную микробиоту. Расчётная дисперсия при повторном тестировании одних и тех же образцов составила 0,25 log2RFU для Bacteroidetes и 0,37 log2RFU для AFFV. Общая дисперсия выборки, включающая дисперсию, внесённую повторным отбором проб и повторным тестированием, была оценена в 0,78 log2RFU для Bacteroidetes и 1,16 log2RFU для AFFV.

Из образцов VLP, содержащих детектируемое количество ДНК, PS2 дал в 6,7 и 4,4 раза большую концентрацию общей ДНК для мазков с кожи и ран соответственно по сравнению с PS1. Ожидается, что остаточные фракции, которые содержат значительные количества микроорганизмов, будут содержать больше ДНК, и, как и ожидалось, практически все образцы кожи и ран дали детектируемое количество ДНК в остаточной фракции. Кроме того, PS2 дал в 3,9 и 16,6 раз более высокую концентрацию общей ДНК по сравнению с PS1, что указывает на то, что PS2 также увеличит выход ДНК для полного исследования метагенома. Роль микробиома в здоровье и болезни человека стала все более признанной за последнее десятилетие. Методологические усовершенствования в обработке шаблонов, секвенировании и биоинформатике имеют решающее значение для продвижения исследований филогенетического и полезного разнообразия микроорганизмов, колонизирующих организм человека.

При использовании PS1 только 10% фракций кожных ВЛП и 25% фракций раневых ВЛП дали детектируемую ДНК. Однако PS2 продемонстрировал значительное улучшение, обеспечив детектируемую ДНК в 30% образцов кожных ВЛП и 100% образцов раневых ВЛП (рис. 5).